前言

 

 

 

 

上篇文章中介绍的两篇论文聚焦于标志物的发现，但无法阐明标志物和疾病的具体关系。在研究中，探究疾病靶点并寻求新的治疗方式对于改善疾病的预后具有重大意义，接下来两篇文章主要聚焦于分子机制的探讨。

 

高转移率和高复发率，是OSCC的一些主要特征，与OSCC的高死亡率相关。因此，通过研究揭示OSCC增殖和转移的潜在分子机制可能为开发新的预防OSCC进展的治疗方法提供重要信息。

 

 

Part. 3

 

 

第三篇发表于Journal of Cell Communication and Signaling，题为“高通量蛋白质组学检测福尔马林固定石蜡包埋组织用于分析口腔癌的分子改变”（Molecular alterations in oral cancer using high-throughput proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue），目的是研究口腔鳞状细胞癌分化的潜在分子机制，并寻找提示组织学类型的潜在鉴别蛋白。

 

 

 

 

▲ 主要内容

 

作者收集了高分化、中分化和低分化OSCC患者的福尔马林固定石蜡包埋切片（FFPE)标本，各6例，混合后进行TMT标记定量检测。共鉴定到4367个蛋白，其中2376个蛋白在三种样本的4次重复中共同被定量到，且三组表现出不同的蛋白表达模式。作者分析了蛋白质组数据中表观遗传调控因子和细胞因子、趋化因子，发现不同组别的肿瘤中存在表观遗传的调控差异。同时作者将蛋白质组的数据与代谢途径进行分析，以确定不同组别的肿瘤中发生的代谢重编程，发现氨基酸代谢、TCA 循环和氧化磷酸化等途径在不同级别的肿瘤中发生了细微变化；而属于细胞周期、缺氧、氧化应激和氧化磷酸化等过程的蛋白质无明显的趋势。

 

 

 

 

对差异蛋白质进行Reactome pathway和GO分析，发现中分化和高分化的差异蛋白主要富集于细胞外基质（ECM）组织、胶原形成、肌肉收缩和葡萄糖代谢途径，中分化和低分化的差异蛋白主要富集于补体成分激活、脂质消化、ECM受体相互作用途径。

 

 

与高分化OSCC相比，中度OSCC和低分化OSCC中的差异蛋白质富集到了ECM受体相互作用途径，且富集到的蛋白质在中分化OSCC中上调，在低分化OSCC中下调。ECM途径、表观遗传学，在不同级别OSCC样本中存在显著差异。

 

本研究为不同级别OSCC的蛋白质组学分析，为了解分化的潜在分子机制提供了新的见解。

 

▲ 研究方法总结

 

临床研究方法：本研究属于分子机理研究，纳入不同分化类型的口腔癌共18例，即高分化、中分化和低分化口腔癌各6例。

 

变量：将收集的 FFPE 组织标本按照分组进行混合，合并成3个样本，使用TMT标记定量蛋白质组学的方法进行定量检测，进行4次重复，得到蛋白质定量结果。

 

统计方法：差异倍数大于1.5，p值小于0.05的蛋白被认为差异上调蛋白，而差异倍数小于0.66，p值小于0.05的蛋白被认为差异下调蛋白。

 

分子机制探究方法：将蛋白列表与基因集数据库（MSigDB）或以往报道的文献进行比较分析，比较蛋白质的分类和功能，如蛋白激酶、磷酸酶、肿瘤抑制基因、致癌基因、表观遗传调节因子、缺氧、氧化应激和代谢等。使用Enrichr进行了GO富集分析，以及Reactom通路富集分析。

 

▲ 可完善之处

 

本研究仅纳入了每组6例，共18例样本，样本较少；且将每组样品混合，更有可能掩盖了个体之间的其他信息。

 

虽然文章进行了分子机制的探讨，但并未得出明确的结论，也未对结论进行验证。

 

Part. 4

 

第四篇发表于Signal transduction and target therapy，题为“NUPR1通过激活TFE3依赖性自噬促进口腔鳞癌细胞增殖和转移”（NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy）。目的是发现OSCC增殖和转移的潜在分子机制。

 

 

 

▲ 主要内容

 

作者首先对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤样本进行高灵敏度非标记定量蛋白质组学分析，发现与非淋巴结转移(LNM)的OSCC患者相比，LNM患者有208个上调蛋白，165个下调蛋白，与非LNM组相比，LNM组的NUPR1表达明显上调。由此，作者认为NUPR1可能是参与OSCC进展的重要蛋白。

 

 

 

 

作者下一步在更大的患者队列中验证了蛋白质组学结果，对组织切片进行免疫组化染色检测OSCC组织芯片中的NUPR1的蛋白表达水平，结果显示，与正常黏膜组织相比，OSCC组织中NUPR1的表达显著增加。NUPR1的表达与TNM分期和淋巴转移呈正相关，且NUPR1表达水平较高的OSCC患者的总生存率较低。由此作者发现NUPR1与患者的OSCC进展和不良预后呈正相关。

 

为了明确NUPR1在OSCC进展中的作用，作者在OSCC细胞系Cal27和HN6中敲低NUPR1，发现敲低NUPR1显著降低了Cal27和HN6细胞的集落形成效率，且OSCC细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制。由此可知敲低NUPR1抑制了OSCC的进展。

 

 

 

为了阐明NUPR1在OSCC进展中的潜在机制，作者通过TMT定量蛋白质组学分析检测了NUPR1敲低的Cal27细胞的蛋白质组的变化。结果显示，敲低NUPR1的OSCC中27个蛋白水平显著上调，28个蛋白水平显著下调，KEGG通路分析表明这些差异蛋白主要富集在自噬通路上。由此作者猜想，自噬可能在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用。

 

 

 

MAP1LC3B-I蛋白在自噬中起着重要的作用，是一种公认的自噬标志物，通常驻留在细胞质中，但在自噬诱导后，它被脂化并嵌入自噬体膜中(形成MAP1LC3B-II亚型)，GFP-LC3可以作为自噬体形成的标志物。ATG5与ATG12和PIK3C3/VPS34激酶的活性结合，是细胞中吞噬体形成的必要条件。多泛素化蛋白聚集物是成熟自噬体的重要组成部分，由SQSTM1介导，是自噬体的重要组成部分。

 

接下来，作者进一步研究了NUPR1和OSCC细胞的自噬通量的关系。发现敲低NUPR1增加了自噬相关MAP1LC3B-I、MAP1LC3B-II 、SQSTM1的蛋白表达水平，可能意味着敲低NUPR1损害了OSCC细胞的自噬通量。

 

随后作者发现敲低ATG5可以回复敲低NUPR1诱导的OSCC细胞的自噬泡标记物GFP-LC3的增加，MAP1LC3B-II的积累减少，且GFP-LC3和SQSTM1的共定位增强。这些结果表明，敲低NUPR1不影响自噬体的形成，且不能促进OSCC细胞中自噬小体的货物掺入或成熟。

 

此外，作者还发现自噬体标记物GFP-LC3和溶酶体标记物LAMP2之间的共定位比例不受敲低NUPR1的影响，说明敲低NUPR1对OSCC细胞中的自噬体-溶酶体融合无影响。

 

为了研究敲低NUPR1是否抑制溶酶体功能，作者检测了位于溶酶体膜表面的溶酶体标记物LAMP1和LAMP2的表达水平，以及进行了DQ-BSA蛋白水解活性测定实验。结果表明，敲低NUPR1抑制了OSCC细胞中LAMP1的表达，但未抑制LAMP2的表达，溶酶体蛋白水解活性明显被抑制，OSCC细胞中的PH发生显著变化。这些结果表明，敲低NUPR1对自噬通量的损害可能是通过抑制OSCC细胞中的溶酶体功能来介导的。

 

 

 

 

 

为了阐明NUPR1介导的自噬-溶酶体加工的潜在机制，作者通过蛋白质组学分析了含有敲低NUPR1的OSCC细胞与对照组之间的差异蛋白，发现敲低NUPR1显著降低了TFE3的表达水平。PCR显示参与自噬通量的“TFE3下游应答基因”表达同样发生了变化，荧光素酶报告基因分析显示敲低NUPR1的OSCC细胞中TFE3启动子活性明显被抑制。发现NUPR1与TFE3呈正相关，过表达TFE3可以显著挽救敲低NUPR1对OSCC细胞溶酶体功能的损伤。这些结果表明，在OSCC进展过程中，NUPR1通过增加TFE3启动子活性和激活TFE3转录来维持自噬通量。

 

 

 

作者进一步猜想，NUPR1通过激活TFE3依赖的自噬促进OSCC进展，于是在体外过表达TFE3，观察NUPR1缺陷OSCC细胞进展能力及致瘤能力的变化。结果表明，TFE3过表达部分回复了敲低NUPR1介导的OSCC细胞迁移和侵袭的抑制作用。敲低NUPR1抑制皮下瘤的发展及转移性结节的形成，且抑制TFE3和下游应答基因的表达。这些发现表明，NUPR1通过激活TFE3依赖的自噬促进OSCC的进展。

 

 

 

 

 

在本研究中，作者对福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤样本进行高灵敏度非标记定量蛋白质组学分析，并结合NUPR1敲除OSCC细胞系的TMT标记定量蛋白质组学分析，以确定自噬参与OSCC增殖和转移的可能机制。作者发现并证实了NUPR1在OSCC进展过程中通过激活TFE3转录来维持自噬通量。NUPR1-TFE3介导的自噬过程揭示了靶向药物治疗OSCC进展的潜在新途径。

 

▲ 研究方法总结

 

临床研究方法：本研究属于分子机理研究。纳入10例淋巴转移(LNM)和10例无淋巴结转移病例，以及88例OSCC组织和20例正常黏膜组织样本。

 

首先通过对10例淋巴转移(LNM)和10例无淋巴结转移的石蜡包埋肿瘤样本进行非标记定量蛋白组学分析，发现关键分子并提供相关线索。

 

随后对88例OSCC组织和20例正常黏膜组织验证关键分子的表达差异，并结合临床数据进行生存分析。

 

确定关键分子后，首先确定关键分子在细胞中的表型，随后使用TMT标记定量蛋白质组学的方法进行蛋白质组的分析，分析差异蛋白富集的功能通路。

 

找出可能的通路后，进一步通过分子实验和蛋白质组分析结果确定上下游相关的基因和转录因子，对富集的通路进行验证。

 

随后进一步明确这些基因在细胞和动物中的表型。

 

分子机制探究方法：

 

使用非标记定量蛋白质组学定量石蜡包埋肿瘤样本，得到蛋白定量信息后，以P值<0.05 ，比值≥1.5倍为阈值来确定差异表达蛋白，通过无监督学习层次聚类分析进行聚类，筛选确定关键分子。

 

使用免疫组织化学染色对组织芯片进行染色，统计兴趣分子的表达与病理分化分级、TNM分期和淋巴转移之间的关系。

 

根据克隆形成能力，划痕实验，体外侵袭实验确定兴趣分子的表型。并将敲低兴趣分子的细胞与野生型细胞进行TMT标记定量蛋白质组学实验，进行3次重复，对差异蛋白进行KEGG富集分析。

 

通过免疫印记，免疫荧光，皮下瘤移植等实验，验证通路中的上下游基因和分子功能。

 

结语

 

如何寻找更适合您的研究方式呢？本文分享的2篇研究论文特点总结如下：

 

第三篇文章的研究目的为探究疾病的发生机理，所需样本为临床样本，无需基础科研实验室。在得到蛋白质组定量信息后，仅简单进行富集分析，提出可能的分子通路猜想，未进行验证。相比前两篇文章，此类研究需要更深的疾病机制背景的了解，但对样本的要求更低，可快速得到研究成果。

 

第四篇文章的研究目的为探究癌症转移的机理，所需样本包括临床样本和细胞、动物等，需要基础实验室进行分子、细胞和动物实验。与之前的几篇文章相比，本文研究更为系统和完整，发现了疾病潜在预防和治疗靶点。本文对临床样本的要求更低，主要围绕分子功能和机制通路的验证，工作量较大且需要一定的前期研究基础。

 

 

参考文献

 

1. Mohanty, V., Subbannayya, Y., Patil, S., Puttamallesh, V. N., Najar, M. A., Datta, K. K., Pinto, S. M., Begum, S., Mohanty, N., Routray, S., Abdulla, R., Ray, J. G., Sidransky, D., Gowda, H., Prasad, T., & Chatterjee, A. (2021). Molecular alterations in oral cancer using high-throughput proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Journal of cell communication and signaling, 15(3), 447–459. https://doi.org/10.1007/s12079-021-00609-3

 

2. Fan, T., Wang, X., Zhang, S. et al. NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy. Sig Transduct Target Ther 7, 130 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00939-7