血浆多组学分析揭示新冠肺炎儿童的分子变化-蛋白质组学和代谢组学联合分析案例
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时间：2023-01-05
前言
今天笔者带来一篇近期发表于《Theranostics》（IF=11.553）运用蛋白质组学和代谢组学技术研究新冠肺炎儿童血浆分子变化的文章。该项目是由病毒学国家重点实验室周溪团队、广州市妇女儿童医疗中心徐翼团队以及华中科技大学生命科学与技术学院薛宇团队合作开展研究，谱度众合（武汉）生命科技有限公司在这项研究中也贡献了自己的一份力量。
新冠肺炎是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的急性传染病，截至2021年6月23日，已造成全球近1.8亿人感染和400万人死亡。新冠病毒对所有人群普遍易感，在性别和年龄上无显著差异。但来自不同国家的多项研究表明相比于成年人，新冠肺炎儿童的感染症状要轻，急性呼吸窘迫综合征和多系统炎症综合征等重症在患儿中也比较少见。本文运用多组学技术结合机器学习算法揭示了新冠肺炎儿童相较于成人患者的血浆分子变化，为研究以轻症为主的儿童新冠肺炎的发病机制提供了新的思路。
实验设计
（Figure 1）
研究团队共采集来自广州市妇女儿童医学中心30名儿童的血液样本，其中新冠肺炎儿童18例，健康儿童12例。分离血浆后，进行蛋白质和代谢物分析。在之前的两项研究中，该团队已对新冠肺炎成人患者和健康成人开展了血浆蛋白质组学和代谢组学研究，发现血浆分子疾病相关变化。本文基于这些研究结果将儿童与成人患者的多组学数据进行综合分析，揭示了新冠肺炎儿童相较于成人患者的血浆分子变化差异。
结果一：新冠肺炎患儿分子变化特征
（Figure 2）
以|log2(FC)|>0.25, Adjusted P < 0.05为标准，在新冠患儿和健康儿童中鉴定到121个差异表达蛋白质(DEPs)和416个差异表达代谢物(DEMs)。通过计算新冠患儿与健康儿童和成人患者与健康成人样本中蛋白质和代谢物的归一化丰度值(NAVs)消除成人和儿童之间的固有差异后，作者使用NAVs在儿童患者和成人患者间鉴定到了196个DEPs和449个DEMs。其中表达上调和下调的DEPs数目无明显差异，但下调的DEMs数目远大于上调的DEMs，表明儿童患者对代谢过程的抑制作用比成人患者更强。GO和KEGG富集分析发现儿童患者与健康儿童或成人患者之间有许多重叠的生物学过程和代谢途径。把两组差异表达结果取交叉后最终确定44个DEPs和249个DEMs在新冠肺炎儿童中发生独特改变，其功能富集分析结果表明凝血相关过程在蛋白质水平上高度富集，而参与氨基酸生物合成的合成代谢相关途径在代谢水平上高度富集。
结果二：基于机器学习算法确定最优组合模型
（Figure 3）
（Figure 4）
利用机器学习技术，研究团队设计了“最小偏差的生物分子组合推断”（Inference of biomolecular combinations with minimal bias, iBM）算法，基于五折交叉检验，获得具有最高准确率和最小偏差的蛋白质和代谢物组合模型。通过计算曲线下总面积(AUC)值和总均方根误差(RMSE)来衡量预测偏差，评估候选模型的准确性。最终在总RMSE值为1.83%和7.01E-07的情况下，获得优先级最高的两种生物分子组合模型，分别包含5种蛋白质和5种代谢物。蛋白质组合为凝血因子XI和IX(F11和F9)、烯醇化酶(ENO1)、纤维蛋白原α(FGA)和γ(FGG)链，代谢物组合为甲基丙二酸(MMA)、二氢乳清酸(DHOA)、吲哚乙醛(IAAld)、色氨酸(TRP)和甘露醇。两种模型均可完美地将新冠肺炎儿童与健康儿童或成人患者区分开来，其AUC值为1。此外，对这些分子组合进行混淆矩阵和RMSE分析，结果表明，两种模型对不同样本的区分同样具有很高的准确性。
通过分析蛋白分子功能和在新冠患儿中的表达量发现新冠肺炎患儿可明显诱导免疫应答/炎症反应，同时抗炎过程也被强烈触发。对代谢物的分析发现新冠病毒诱导的免疫应答/炎症反应在可控范围内。这些结果表明新冠患儿的免疫反应、炎症反应、保护性抗氧化及抗炎过程均显著增强，可能与新冠儿童患者症状较轻密切相关。
基于DEPs和DEMs的KEGG注释，研究团队建立了由相关蛋白和代谢物组成的分子模型，展示了差异表达蛋白和代谢物主要的6条信号通路及其相互作用关系。这6条信号通路，包括血小板激活、补体和凝集反应、糖酵解/糖异生、嘧啶代谢、氨基酸合成、TRP代谢，其体内平衡均与年龄相关。
结果三：血浆分子在体外病毒感染模型中的验证
（Figure 5）
研究团队使用小鼠肝炎病毒(MHV，A59株)作为SARS-CoV-2的替代毒株感染大鼠肺上皮L2细胞，建立体外病毒感染模型。与蛋白质组学结果一致，MHV感染后F9、F11、FGA和FGG的mRNA水平显著升高，ENO1的mRNA表达显著降低。在MHV感染背景下分别研究代谢物分子对病毒复制和炎症的功能影响，研究结果发现MMA和甘露醇这两种代谢物能显著降低MHV的RNA水平且4种代谢产物MMA，DHOA，TRP和甘露醇可降低MHV感染细胞中至少一种炎性细胞因子的mRNA表达。此实验不仅验证了在新冠病毒感染时蛋白分子的变化，而且发现其中一些代谢物能有效抑制新冠病毒复制及炎症因子表达。
总结
综上，本文运用多组学技术结合机器学习算法对新冠肺炎儿童患者的血浆分子进行系统分析，不仅揭示了新冠患儿血浆分子的大量独特变化，同时也为儿童患者与成人之间临床表现差异的原因提供了可能的解释。此外，该研究鉴定出多种具有抗病毒及抗炎活性的血浆分子，这些独特的血浆分子可能在儿童感染新冠病毒过程中起到阻止病情恶化及免疫调节作用，同时也为新冠病毒治疗药物及免疫抑制剂的研发提供了新的思路。
蛋白质组学和代谢组学的联合分析是一直是多组学研究的一个热点，但由于蛋白质组和代谢组的差异性，其联合分析也是一个难点。本文展示了目前蛋白质组学和代谢组学联合分析最常用的一种方法，即通过KEGG对蛋白质和代谢物的信号通路进行注释，并将差异表达蛋白和代谢物归纳到相关的信号通路中，从而建立联合分析的分子模型。
