从姜黄素到奎宁经过14个案例拆解，我终于摸清了天然药物靶点筛选的适配逻辑！

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阅读：148 时间：2025-11-25

长期扎根于天然药物靶点筛选这块沃土，我总觉得技术选择就像 “给作物选农具”—— 没有绝对的 “最好”，只有 “适配场景的最优”。过去几年，从最初靠 DARTS 做低成本初筛，到用 CETSA 验证体内靶点，再到尝试 TPP 做全蛋白组探索，踩过不少坑，也积累了一些权威文献的实践经验。

今天就从实际研究出发，和大家聊聊 DARTS、SPROX、CETSA、TPP 这四种无标记技术在天然药物靶点筛选中的应用细节、各自的 “用武之地”，以及技术间如何搭配使用，希望能给各位研究者提供一些参考。

一、DARTS：天然药物靶点初筛的 “性价比之选”

第一次用 DARTS 是研究一种难修饰的黄酮类天然产物 —— 没有合适的活性基团做标记，亲和层析根本没法用，最后抱着试试的心态用了 DARTS，没想到真筛出了潜在靶点。现在回想，DARTS 能成为很多实验室的 “初筛标配”，核心在于它 “简单、便宜、不挑样品”。

1.核心逻辑与天然药物的适配性

● DARTS 的原理很直观：药物和靶点蛋白结合后，蛋白结构会更稳定，面对胰蛋白酶这类蛋白酶时，降解速率会变慢。我们只需要把天然药物（或粗提物）和细胞裂解液孵育，加蛋白酶消化后，通过 SDS-PAGE 检测 “没被降解的蛋白”，就能锁定潜在靶点。

这种 “不修饰药物” 的特性，对天然产物太友好了 —— 很多天然药物（比如萜类、生物碱）结构复杂，强行修饰会破坏活性，而 DARTS 直接用原生药物孵育，完全保留其生物活性。

【比如在研究姜黄素时，研究者用 DARTS 在 HCT116 细胞裂解液中孵育后，发现 STAT3 蛋白的降解量比对照组少 40%，后续通过 WB 和分子对接验证，确认 STAT3 是姜黄素抗结直肠癌的关键靶点，整个初筛过程成本不到 500 元。】

2.实际应用中的优势场景

● 粗提物初筛，快速缩小范围：研究中药复方或植物粗提物时，我们没法先分离单个成分，DARTS 可以直接用粗提物孵育样本，筛选出能被 “活性成分保护” 的蛋白。

【研究丹参粗提物时，用 DARTS 发现 PI3K 蛋白在提取物处理组的降解率显著降低，后续分离出丹酚酸 B 验证，确认丹酚酸 B 是结合 PI3K 的主要活性成分，比先分离再筛选节省了 2 个月时间。】

● 捕捉低亲和力靶点，避免漏检：天然药物常存在 “多靶点弱结合” 的特点，传统亲和层析需要强亲和力才能 “拉” 住靶点，容易漏检低亲和力靶点。而 DARTS 没有洗涤步骤，即使药物与靶点是弱相互作用，也能通过 “抗降解” 信号检测到。

【比如白藜芦醇通过 DARTS 筛选时，除了已知的高亲和力靶点 SIRT1，还捕捉到了低亲和力靶点 eIF4A（降解率降低 25%），后续功能实验证明 eIF4A 在白藜芦醇抑制肿瘤转移中起重要作用。】

3.不得不注意的局限

● DARTS 的短板也很明显：低丰度蛋白难检测 —— 如果靶点蛋白在细胞中含量低，即使被药物保护不降解，凝胶上也难显影。

【我之前研究一种生物碱时，DARTS 没检测到低丰度的膜蛋白，后续用 CETSA 才确认其结合；另外，膜蛋白本身对蛋白酶消化的抵抗力较强，可能会被误认为是 “药物保护的靶点”，需要后续用其他技术交叉验证。】

二、CETSA：天然药物靶点 “体内验证的金标准”

如果说 DARTS 是 “初筛探路者”，那 CETSA 就是 “验证把关人”。我第一次用 CETSA 是为了确认 DARTS 筛出的靶点是否在体内真的结合 —— 体外实验做得再好，体内不结合也没用，而 CETSA 恰好能解决 “体内外差异” 这个痛点。

1.核心逻辑与天然药物研究的契合点

● CETSA 的核心是 “热稳定性变化”：未结合药物的蛋白加热到一定温度（比如 50℃）会变性沉淀，结合药物的蛋白热稳定性提升，同样温度下仍能溶解。通过 Western blot或免疫荧光检测溶解液中的蛋白，就能判断药物是否与靶点在细胞 / 组织中结合。

这种 “在生理环境中验证” 的特性，对天然药物研究至关重要。

【研究抗肝癌生物碱 HTBPI 时，先用化学 proteomics 推测靶点是 AKT，但体外结合实验不能证明体内也结合；后来用小鼠肝癌组织做 CETSA—— 加热到 45℃时，HTBPI 处理组的 AKT 溶解量是对照组的 2.3 倍，直接证明了 HTBPI 在体内能结合 AKT，这是体外技术无法替代的。】

2.实际应用中的关键价值

● 体内靶点验证，贴近临床场景：天然药物最终要用于体内，体外筛选的靶点常与体内情况脱节。CETSA 能直接用完整细胞、动物组织甚至患者活检样本做实验，结果更贴近实际疗效。

【研究青蒿素抗疟时，用恶性疟原虫感染的红细胞（完整细胞）做 CETSA，发现青蒿素处理组的 MD2 蛋白在 57℃仍能溶解，对照组则沉淀，证明青蒿素在疟原虫感染的红细胞中确实结合 MD2，为后续临床剂量设计提供了依据。】

● 量化药物效能，指导剂量优化：CETSA 的 “等温剂量反应（ITDR-CETSA）” 模式能计算 EC50 值，评估药物结合靶点的 “ 效能 ”。

【研究藤黄酸（抗胰腺癌天然产物）时，ITDR-CETSA 显示其结合 Bcl-2 的 EC50 是 20μM，据此设计动物实验剂量（15mg/kg），既保证了靶点结合率，又避免了毒性，比盲目试剂量节省了大量动物资源。】

3.实际操作中的挑战

● 低通量：一次 WB-CETSA 只能检测 1-2 个靶点，要是想验证 TPP 筛出的十几个潜在靶点，得跑十几轮实验。

● 依赖高质量特异性抗体：如果靶点蛋白没有商业化抗体（比如一些新发现的转录因子），就只能放弃，这在天然药物筛选中很常见。

三、SPROX：天然药物 “结合机制解析的利器”

1.核心逻辑与天然药物机制研究的适配性

● SPROX 基于“甲硫氨酸氧化速率变化”：蛋白中的甲硫氨酸残基容易被氧化，药物与靶点结合后会改变蛋白空间结构，进而影响甲硫氨酸的氧化速率 —— 结合药物的蛋白，甲硫氨酸氧化变慢（或变快）。通过量化氧化比例，不仅能判断是否结合，还能算出结合热力学参数（如 ΔG），解析结合机制。这种 “量化结合特性” 的能力，对天然药物机制研究很重要。

【研究环孢素 A（天然免疫抑制剂）时，通过SPROX 不仅确认了已知靶点亲环蛋白 A，还算出结合自由能 ΔG，同时发现新靶点 GalE，为解释环孢素 A “多靶点协同免疫抑制” 提供了热力学依据。】

2.实际应用中的独特价值

● 补充验证，排除间接作用：有时候 DARTS 发现蛋白 “抗降解”、CETSA 发现 “耐热”，但不确定是药物直接结合还是间接作用（比如下游信号激活导致蛋白稳定）。SPROX 能通过检测甲硫氨酸氧化变化，确认是直接结合导致的稳定性变化。

【研究小檗碱时，DARTS 显示其保护 AMPK 不降解，SPROX 进一步发现 AMPK 的甲硫氨酸氧化率降低 30%，直接证明小檗碱与 AMPK 的直接结合，排除了 “下游信号激活” 的干扰。】

● 适配定量蛋白质组学，提升通量：传统 SPROX 通量低，但升级后的 SILAC-SPROX（稳定同位素标记结合 SPROX）能同时分析多个蛋白。

【用 SILAC-SPROX 研究茶多酚提取物，一次检测了 200 多个含甲硫氨酸的蛋白，发现 EGCG 能特异性降低 ALDH1A3 的甲硫氨酸氧化速率，后续验证其是 EGCG 抗肝癌的关键靶点，通量比传统 SPROX 提升了 10 倍。】

3.应用中的限制因素

● 依赖甲硫氨酸：如果靶点蛋白不含甲硫氨酸（虽然少见，但确实存在），SPROX 就无法检测。

● 药物用量大：需要 mM 级浓度，而很多天然产物溶解度低，比如某些萜类化合物，很难达到这个浓度，限制了其应用场景。

四、TPP：天然药物靶点 “全域探索的新选择”

聊完前三种技术，再说说 TPP。我第一次用 TPP 是为了探索一种中药复方的 “多靶点谱”—— 前三种技术要么低通量，要么需要预设靶点，没法满足 “全蛋白组无偏向筛选” 的需求，而 TPP 恰好填补了这个空白。

1.核心逻辑与天然药物多靶点研究的契合

● TPP 可以理解为 “CETSA 的高通量升级版”：同样基于蛋白热稳定性变化，但结合了质谱技术（如 TMT 标记），一次实验能检测细胞或组织中上千种蛋白的热稳定性变化，无需预设靶点，实现全蛋白质组层面的靶点筛选。这种 “无偏向、高通量” 的特性，完美适配天然药物 “多靶点、复杂机制” 的特点。

【研究放线菌来源的天然产物十字孢碱时，TPP 在 K562 细胞裂解液中一次检测了 7000 + 蛋白，不仅筛选出 51 个已知的激酶靶点，还发现了 2 个意外靶点 —— 粪卟啉原 III 氧化酶和亚铁螯合酶，这是之前用 DARTS、CETSA 无法实现的，为其药理机制研究开辟了新方向。】

2.与前三种技术的协同与突破

TPP 不是 “取代” 前三种技术，而是 “互补升级”：

● 突破 “预设靶点” 局限：DARTS、CETSA、SPROX 都需要先有 “潜在靶点列表”，而 TPP 无需预设，能发现未知靶点。

【研究海洋天然产物 13²- 羟基脱镁叶绿素 a 时，ABPP 技术（需修饰）没找到靶点，TPP 却在 HepG2 细胞中发现 9 个脂质调节相关靶点，包括 RPSA、FGG 等新靶点，后续功能实验证明这些靶点协同调控脂质代谢。】

● 解决 “高通量” 痛点：DARTS、CETSA、SPROX一次最多分析几十个蛋白，而 TPP 一次能分析上千个。

【研究中药白术的活性成分 atractylenolide I 时，TPP 一次就发现了 PSMD4、CGGBP1、SORBS3 三个靶点，后续用 CETSA 逐一验证，效率比单独用 CETSA 提升了 3 倍。】

● 适配复杂样本，解析全景机制：TPP 能在组织样本中做全蛋白组筛选，不仅能找到直接靶点，还能发现下游蛋白变化。

【研究抗疟药奎宁时，TPP 在恶性疟原虫感染的红细胞中，不仅找到直接靶点 PfPNP，还发现了下游嘌呤代谢相关蛋白（如 HGPRT）的热稳定性变化，完整解析了奎宁 “抑制嘌呤合成” 的抗疟机制。】

3.实际应用中的注意事项

数据分析需要专业工具（如 R 包 TPP、ProSAP 软件），需要一定的生物信息学基础。但对于 “发现新靶点、解析多成分复方” 这类核心需求，这些投入是值得的。

五、技术核心对比

六、结语：技术选择的核心是 “适配研究目标”

这些无标记技术的发展为天然药物靶点筛选提供了“不破坏天然产物活性、贴近生理场景、适配多靶点特性” 的解决方案。其中，DARTS 与 SPROX 在初筛与机制解析中不可或缺，CETSA 是体内验证的关键，而 TPP 则凭借高通量、无预设靶点的优势，成为天然药物 “新靶点发现与复杂机制解析”的核心推动力。

作为研究者，我们需明确：技术选择应紧扣研究目标 —— 初筛选 DARTS，机制解析选 SPROX，体内验证选 CETSA，新靶点探索选 TPP。唯有基于文献指导的技术搭配，才能高效、准确地挖掘天然药物的靶点价值，为后续药物开发奠定基础。