蛋白互作组学系列丨（二）理想的IP-MS结果始于实验材料的选择
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时间：2025-03-25
IP是一种经典的实验技术，通常会与SDS-PAGE和WB结合使用来检测蛋白。因此许多研究者在设计IP－MS实验进行互作蛋白筛选时，往往会参考以往IP-WB的实验经验以及传统蛋白质组学研究中的胶内酶解样品制备方法，而未能随质谱仪器性能的提升和数据分析方法的发展对实验方法和策略进行调整和优化，导致最终蛋白相互作用的检测结果并不理想。
我们根据自身及合作者们多年的研究经验，并参考已发表的IP-MS经典案例，总结了专门针对基于质谱检测的蛋白互作研究的IP实验方法，希望能为更多的相关领域的研究者提供帮助。
本期将分享关于IP－MS实验中样品及各类实验材料的选择和建议。
1、细胞用量
IP-MS实验通常从细胞或组织样品的裂解开始。
相比具有级联放大反应的WB实验，质谱检测的灵敏度在大多数情况下要稍低一些，此外，与特异性检测靶标蛋白的WB不同，质谱检测理论上会对样品中的所有蛋白成分进行检测，因此用于质谱检测的IP实验相比传统IP-WB所需起始细胞量更多。
IP－MS实验起始细胞用量主要需根据细胞种类、靶标蛋白表达丰度、亲和抗体效价等因素进行调整。通常每个样品起始细胞量建议不少于2e7。如果是靶标蛋白高表达的细胞系，如过表达的标签蛋白，或是细胞内高表达的内源性蛋白（如Actin、RPS等）可适当降低细胞用量，但建议不少于1e7。在一定范围内，细胞用量越多，能够获得的质谱检测结果越好。
如果实验采用的是人源的细胞或组织，其中靶标蛋白的表达丰度可参考：
Proteomics DB（https://www.proteomicsdb.org/）和
Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）
数据库中的蛋白表达信息。前者来源于已公开的质谱检测数据，后者主要来源于RNA测序和抗体相关实验的检测数据。
已发表的IP-MS经典案例中单个样本细胞用量
2、抗体选择
抗体是决定IP实验是否成功的最关键因素。目前各种常见的标签抗体通常都具有良好的特异性和效价，足以满足IP-MS的实验需求，得到良好的检测结果。但针对各类内源性蛋白的商业化抗体，其效果往往难以保证。
有研究统计过数千种商业化抗体的检测效果，其中能够在WB实验中获得良好结果的不到1/4，在WB实验中明确结果无效的接近一半。通常来说，IP实验对抗体的要求较WB更高，而为了尽量降低由抗体非特异性导致的假阳性互作鉴定结果，IP-MS中所用的抗体相比传统IP-WB，也会有更高的要求。
因此，用于IP-MS实验的抗体，建议经过以下4步进行筛选和验证：
1） 尽量选择已标明可用于IP实验，以及已有研究者使用过的抗体。可参考数据库：
Validated Antibody Database (https://www.labome.com/index.html)。
2） 查询抗体生产厂商及以前使用者提供的使用结果，排除条带大小与靶标蛋白理论大小存在显著差异及非特异性条带和背景较多的抗体。
3） 购买抗体后进行IP-WB预实验，根据结果判断抗体效果。优先选择条带大小与靶标蛋白一致，且无其他非特异性条带的抗体。
4） 通过质谱检测对少量IP-MS样品进行蛋白鉴定，选择靶标蛋白的检测信号排名靠前的抗体。在某些情况下，厂商提供的抗体可能会特异性识别与其标注靶标不同，但分子量接近的其他蛋白，这种情况往往难以通过IP-WB实验进行验证。
3、亲和微珠
亲和微珠就是我们IP实验中所说的“beads”。IP所用的beads通常由2部分组成，即基质材料和IgG结合蛋白。目前常用的基质材料有两种，一种是琼脂糖（Agarose/Sepharose），另一种是磁珠（Magnetic/Dynabeads）。相比琼脂糖beads，磁珠beads通常亲和效价更高，操作更简单，清洗效果更好，但成本也稍高。在IP-MS实验中更建议使用磁珠进行实验。
Beads中的IgG结合蛋白通常可分为Protein A，Protein G和Protein A/G。针对IP实验中最常用的鼠抗和兔抗，Protein A和Protein G均能有效结合，但二者针对其他种属的抗体结合能力略有差异。Protein A/G是同时含有Protein A和Protein G抗体结合结构域的融合蛋白，对绝大部分IP实验中采用的抗体均能有效结合。
如果是针对标签蛋白进行亲和纯化，目前市售的大部分标签亲和beads均可实现良好的亲和纯化效果，而无需额外购买标签抗体进行孵育。
4、裂解液、清洗液和洗脱液
裂解液通常主要由去垢剂、抑制剂和缓冲体系三部分组成。
IP所用的裂解液中，去垢剂通常为 0.5%-2%的NP40或TritonX-100，也可二者联合使用。为了提高裂解效率，少数裂解液中也会含有0.01%浓度的SDS或SDC。但需要注意的是，其他裂解液中常用的高浓度SDS（>0.1%）会严重破坏蛋白与蛋白的相互作用，因此通常不能使用在IP实验中。
由于IP实验需要进行孵育，为了避免蛋白降解，裂解液中通常需要加入蛋白酶抑制剂。此外也可根据靶标蛋白类型及具体的研究目的，额外添加磷酸酶抑制剂或全能核酸酶。
IP缓冲液中常见的缓冲体系为150 mM NaCl/50 mM Tris-HCl，pH 7.5。不同课题组和研究者所用的盐浓度和pH值可能略有差异。需要注意的是，高盐浓度的缓冲体系（＞300 mM NaCl）会很大程度上破坏较弱的蛋白相互作用，导致质谱检测的蛋白鉴定结果急剧减少。
在常规的IP-WB实验中，通常可直接以裂解液作为清洗液，以含有高浓度SDS、溴酚蓝和β-巯基乙醇的loading buffer作为洗脱液。但在IP-MS实验中，为了更适配后续的质谱检测样品处理，需要清洗之后的样品中不含有去垢剂成分。因此建议以不含去垢剂的缓冲体系，或PBS作为清洗液，或在常规清洗液清洗后，以PBS或缓冲体系进行清洗置换。为了尽量保留样品中的互作蛋白，避免样品制备过程中的蛋白损失，建议清洗之后直接以beads沉淀进行后续用于质谱检测的样品制备，而不进行蛋白的洗脱。
5、总结
IP-MS实验的检测结果很大程度上取决于IP实验的效果。但与实验室中更常规的IP-WB实验不同，IP-MS实验中的IP部分具有一些特殊的要求，主要为：
（1）细胞用量要求更大，建议不少于2e7
（2）抗体特异性和亲和效价要求更高，尽量采用标签抗体或经过IP效果验证的抗体
（3）IP后Beads需清洗去除NP40等去垢剂，可使用PBS等作为清洗液
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