服务案例Theranostics | 解读《双嘧达莫作为新型铁死亡抑制剂的表征及其在急性呼吸窘迫综合征管理中的治疗潜力》
阅读：671
时间：2025-01-03
期刊名称：Theranostics
发表时间：2024年10月
影响因子：12.4
期刊分区：JCR 1区/中科院1区
作者单位：安徽医科大学
样本类型：细胞样本
相关产品：LiP-MS药物靶点筛选解决方案
其他信息：LiP-MS、药物靶点筛选、细胞/动物模型
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前言
今天和大家分享一篇我们客户的文章，于2024年10月发表在《Theranostics》（IF=12.4）杂志上，标题为“Characterization of dipyridamole as a novel ferroptosis inhibitor and its therapeutic potential in acute respiratory distress syndrome management”。
谱度众合为满足客户的需求，即筛选出能直接与双嘧达莫（DIPY）结合的靶向蛋白，采用了有限蛋白水解质谱技术（Limited Proteolysis Mass Spectrometry，简称LiP-MS），以辅助筛选潜在的药物结合蛋白。通过进一步的反应组通路分析，我们成功锁定了关键蛋白——超氧化物歧化酶1（SOD1）。本文主要介绍LiP-MS相关的结果。有对LiP-MS感兴趣及相关需求的小伙伴可以借鉴这篇文章的思路并联系我们哦！
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研究背景
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种以急性炎症和肺血管通透性增加为特征的严重肺部疾病。ARDS的核心病理特征之一是肺上皮和内皮细胞损伤，因此靶向修复这些细胞损伤被视为潜在的突破性治疗策略。铁死亡是一种以铁依赖性膜脂质过氧化为特征的非凋亡性细胞死亡形式。研究表明，铁死亡会加剧ARDS患者肺上皮和内皮细胞的损伤，抑制铁死亡有望减轻ARDS的肺损伤。然而，目前尚无获批的靶向铁死亡的ARDS临床治疗药物。
这项研究通过筛选FDA批准的药物库，确定双嘧达莫（DIPY）是肺上皮和内皮铁死亡的强效抑制剂，此外研究发现DIPY通过调节SOD1/CREB1/HMOX1通路抑制铁死亡，并进一步证实了DIPY在两种ARDS小鼠模型和人气道类器官 （hAOs）中的抗铁死亡和治疗作用。
03
实验设计
用RSL3（5 μM）预处理A549细胞(诱导铁死亡)，收集裂解液分别与DIPY以及DMSO（二甲基亚砜）进行孵育，然后用蛋白酶K消化10分钟，而后进行质谱检测，筛选差异表达蛋白。经过Reactome通路富集分析，确定靶蛋白，并通过细胞热转移实验（CETSA）、药物亲和反应靶向稳定性（DARTS）、表面等离子共振（SPR）等实验进一步证明药物与靶蛋白的直接结合。最后使用基因敲除的A549细胞评估靶蛋白是否介导DIPY的抗铁死亡作用。
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实验结果
（1）质谱筛选结果
对DIPY以及DMSO对照处理后的细胞进行质谱检测分析，LiP-MS结果显示，共筛选出对应于47种蛋白质的58条肽段。
图1 蛋白质组学结果
表1 LiP-MS检测结果（58条肽段对应47个蛋白质）
从差异表达蛋白中挑选潜在药物靶点是一个经验性很强的工作，项目交付后，客户与我司工程师围绕这个问题进行了深入的沟通。结合客户的研究问题——铁死亡，我们关注到了其中与氧化过程密切相关的两个蛋白酶SOD1/2（超氧化物歧化酶1/2），分子对接结果显示药物分子DIPY与SOD1的结合能更高，并且药物作用在蛋白活性位点附近，很可能会对其酶活性产生影响。基于这些结果我们建议客户对这个蛋白进行验证。
图2 Reactome通路分析结果
表2 Reactome通路分析结果
（2）DIPY和SOD1的相互作用结果
首先采用细胞热转移测定评估DIPY处理后A549细胞中SOD1的热稳定性。结果显示，与DMSO处理组相比，DIPY提高了SOD1的热稳定性。
图3 CETSA实验结果
药物亲和反应靶标稳定性结果显示DIPY通过增加对蛋白水解的抗性来稳定SOD1。
图4 药物亲和反应靶标稳定性结果
DIPY和SOD1分子对接的三维结合模式图显示，DIPY可能通过几个保守的氢键与SOD1结合。
图5 三维结合模式图
此外，SPR分析表明DIPY直接与SOD1结合（KD=8.83 μM）。
图6 DIPY与SOD1结合的SPR分析
为了检测DIPY对SOD1酶活性的影响，用RSL3（5 μM）和DIPY（0、5 μM、10 μM）处理A549和HUVEC细胞，结果显示DIPY显着提高了ARDS小鼠A549和HUVEC细胞以及肺组织中SOD1的活性。因此，以上结果表明DIPY直接结合并激活肺上皮细胞和内皮细胞中的SOD1。
图7 SOD1的酶活性检测
（3）SOD1介导DIPY的抗铁死亡作用
该研究为了评价SOD1介导DIPY的抗铁死亡作用，在A549细胞中使用shRNA敲低SOD1。结果显示，敲低SOD1导致CREB1磷酸化、HMOX1表达和铁死亡敏感性显著升高。
图8 敲低SOD1的A549细胞中相关指标变化
并且正如预期的那样，SOD1过表达减弱了RSL3诱导的CREB1磷酸化、HMOX1表达和铁死亡增加。
图9 SOD1过表达导致A549细胞中相关指标变化
综合以上实验结果：DIPY直接结合并激活SOD1，然后通过抑制肺上皮细胞和内皮细胞中的CREB1/HMOX1通路抑制铁死亡。
图10 DIPY调节SOD1/CREB1/HMOX1通路示意图
05
结论
该研究从259种FDA批准药物中筛选出了铁死亡的有效抑制剂双嘧达莫（DIPY），研究发现，DIPY在两种ARDS小鼠模型（LPS诱导的急性肺损伤和CLP诱导的败血症）和人类气道类器官（hAOs）中有效减轻了铁死亡和肺损伤，并在临床试验中证明了DIPY辅助治疗能够改善ARDS患者的预后。该研究成果为ARDS的治疗提供了新的策略。
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总结
该研究的亮点首先是进行了“老药新用”的发现，通过筛选FDA批准的药物库，发现了DIPY这一新的铁死亡抑制剂，为ARDS治疗提供了潜在的新药物选择。再通过“药物再利用”使DIPY在治疗ARDS中发挥作用。同时结合了体外细胞实验、体内动物模型和临床试验，全面评估了DIPY的治疗效果和安全性。
该研究也存在一些局限性。仅有5名患者参与临床验证实验，这可能限制了结果的普遍性和统计力度；同时研究中没有详细探讨不同患者群体（如不同年龄、性别、基础健康状况）对DIPY治疗反应的差异，尽管研究中未观察到明显的副作用，但对于DIPY的全面风险评估和副作用监测仍需在更大规模的临床试验中进行。
综合来看，文章对于新药物的筛选、药物作用靶蛋白的筛选及机制研究及临床验证实验的步骤流程十分严谨，并且对于相关实验方法的选择也有的放矢，十分值得借鉴学习。
本文由谱度众合“生物标志物发现与药物靶点筛选平台”（该平台被认定为“国家生物产业基地公共服务平台”）利用LiP-MS技术完成药物靶点筛选的工作。
以上就是我们今天的全部分享内容，如果老师们想要进一步了解LiP-MS技术的原理以及具体操作步骤，可以看一看本公司公众号文章《最直接真实的药物靶点筛选实验——LiP-MS药物靶点筛选技术》。谱度众合致力于简化科研流程，为您提供全程科研服务，助您摆脱繁琐操作和耗时任务，为您的科研保驾护航！
参考文献
Chen X, Shen J, Jiang X, et al. Characterization of dipyridamole as a novel ferroptosis inhibitor and its therapeutic potential in acute respiratory distress syndrome management. Theranostics. 2024;14(18):6947-6968. Published 2024 Oct 21. doi:10.7150/thno.102318
