期刊名称：Molecular&Cellular Proteomics 

发表时间：2024年1月

影响因子：7.4 

期刊分区：JCR 1区/中科院生物学2区

作者单位：南京医科大学药学院 

样本类型：细胞

其他信息：细胞、动物模型，IP-MS，数据库挖掘

1. 前言

今天和大家分享一篇将蛋白质组学技术应用于疾病靶点研究的论文，题目为“Proteomic Analysis Revealed the Potential Role of MAGE-D2 in the Therapeutic Targeting of Triple Negative Breast Cancer”，于今年一月份发表在Molecular & Cellular Proteomics（IF=7.4）杂志上。

2. 研究背景

三阴性乳腺癌（TNBC）是指在癌组织免疫组化检测中，雌激素受体（ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(Her-2)均为阴性的乳腺癌，在所有乳腺癌病理类型中占比10%-20.8%，且最具侵袭性。

TNBC的病理学特点表现为组织学分级较高、发病年龄较早、肿瘤体积较大、发生内脏转移和骨转移的几率较大。与非三阴性乳腺癌相比，TNBC的死亡率更高，中位生存期更短。目前，TNBC主要的治疗手段仍是手术结合化疗、放疗，亟需有效的靶向治疗策略。

3. 研究样本

临床样本：50对TNBC肿瘤样本（癌和癌旁）用于免疫组化验证

细胞系/动物模型：4株TNBC细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-157、MDA-MB-468和HCC1937）和正常乳腺细胞系MCF-10A；裸鼠原位肿瘤移植模型。

4. 实验设计

研究分为三个部分：

1) 通过挖掘临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）数据库筛选出TNBC潜在治疗靶点，通过免疫组化和细胞/动物实验验证其在肿瘤中的生理功能。

2) 对敲低MAGE-D2的三阴性乳腺癌细胞进行蛋白质组学分析，揭示MAGE-D2相关生理过程及信号通路。

3) 通过IP-MS技术筛选MAGE-D2互作蛋白，分析他们的功能关系。

图 1 研究实验流程

5. 实验结果

1) MAGE-D2靶点的发现与功能分析

研究分析了CPTAC数据库中前瞻性收集的15个TNBC患者肿瘤组织和18个癌旁乳腺组织的蛋白质组学数据，筛选出了与TNBC相关的578个差异表达蛋白(图2A)。然后通过STRING数据库分析这些差异蛋白在智人背景中的相互作用情况，筛选出了8个相互作用最多的蛋白（表1）。在这8个蛋白中，差异表达倍数最高的前两个蛋白在之前的研究中已被证明与TNBC相关，而排名第三的蛋白MAGE-D2在TNBC中的相关研究很少，因此后续研究聚焦于MAGE-D2蛋白。

研究对收集到的50对TNBC（癌和癌旁）肿瘤样本进行免疫组化分析，验证了MAGE-D2在TNBC肿瘤中的表达水平更高（图2B-C）。Kaplan‒Meier生存分析发现MAGE-D2低表达的患者的整体生存率高于MAGE-D2高表达的患者。

图2 蛋白质组学分析发现MAGE-D2在TNBC中的高表达

此外，研究还在细胞和动物模型中证明了MAGE-D2对TNBC肿瘤的增殖和转移具有促进作用。细胞增殖实验和细胞划痕实验表明，MAGE-D2敲低抑制TNBC细胞增殖和迁移，MAGE-D2过表达则促进TNBC细胞增殖和迁移(图3A-B)。同样地，研究利用裸鼠的肿瘤原位移植模型证明了MAGE-D2在体内也具有调节TNBC肿瘤增殖和转移的功能（图3C-D）。

图3 MAGE-D2促进TNBC肿瘤增殖与转移

2) LFQ分析揭示MAGE-D2相关信号通路

研究在两株TNBC细胞系中比较了MAGE-D2敲低和正常表达情况下的蛋白质组定量差异(图4A)。在231细胞系中鉴定到了4309个蛋白和268个差异表达蛋白(DEPs)，在157细胞系中鉴定到了5021个蛋白和560个DEPs(图4B-C)。两株细胞系有71个共同DEPs。对这71个共同DEPs进行GO富集分析发现MAGE-D2基因敲低与PI3K-AKT信号通路密切相关。进一步的实验表明MAGE-D2敲低细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平显著降低，MAGE-D2过表达细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平显著升高。

图4 LFQ蛋白质组学分析揭示MAGE-D2相关信号通路

3) IP-MS实验发现MAGE-D2与Hsp70相互作用

为进一步研究MAGE-D2在TNBC调控中的作用机制，在高表达MAGE-D2的231细胞中进行了IP-MS研究(图5A)。三次重复实验分别鉴定到45、31和105个蛋白，以至少在两次重复实验中鉴定到的标准筛选出了29个MAGE-D2互作蛋白，而这29个互作蛋白中仅有Hsp70为LFQ定量实验中的差异表达蛋白(图5B)。IPA( ingenuity pathway analysis)分析表明Hsp70可能通过组蛋白（histone h3）与MAGE-D2相互作用。免疫共沉淀和免疫荧光染色实验进一步证明了MAGE-D2与Hsp70的相互作用(图5D-F)。

图5 IP-MS鉴定MAGE-D2相互作用蛋白Hsp70

最后，研究对MAGE-D2与Hsp70的功能关系做了进一步的探究。细胞增殖与迁移实验表明抑制Hsp70能抑制MAGE-D2对肿瘤细胞的增殖与迁移的促进作用(图6A-B)。RT-PCR结果显示MAGE-D2对Hsp70mRNA的表达水平没有显著影响，但MAGE-D2能抑制Hsp70泛素化进而抑制其通过泛素-蛋白酶体途径降解(图6C-E)。

图6 MAGE-D2促进Hsp70表达进而促进肿瘤细胞增殖和转移

（VER-155008：Hsp70抑制剂；CHX：蛋白质合成抑制剂；MG132：蛋白酶体抑制剂）

6. 结论

本研究的主要发现有三点：(1)MAGE-D2在TNBC中高表达；(2)MAGE-D2过表达可通过激活PI3K-AKT途径促进细胞的增殖和转移；(3)MAGE-D2与Hsp70相互作用并抑制其降解。这些结果暗示MAGE-D2在TNBC中发挥重要作用，可能是一个潜在的治疗靶点(图6F)。

7. 总结

本研究作为一篇疾病靶点研究的论文，其研究思路可以供大家借鉴。先从数据库（CPTAC）挖掘入手，筛选出了TNBC的潜在靶点MAGE-D2；然后结合多种蛋白质组学分析技术（定量、IP-MS）探究MAGE-D2相关信号通路和互作蛋白；最后在肿瘤细胞系及动物模型中通过分子实验验证MAGE-D2及其互作蛋白Hsp70的功能及相互作用关系。

但本研究也有一些不足之处。众所周知，TNBC具有很强的异质性，众多的分子分型研究也表明其不同分型间具有基因-蛋白质组差异，而本研究中的靶点MAGE-D2在不同TNBC亚型中的表达差异尚待进一步研究。此外，研究通过IP-MS及Co-IP和免疫荧光实验证明了MAGE-D2与Hsp70间的相互作用，但IPA分析表明他们之间的相互作用可能是间接的，研究中的交联质谱(XL-MS)实验也并未得到阳性的结果。因此，MAGE-D2与Hsp70之间的具体相互作用模式也存在疑问。

文献原文：

Shi X, Liu C, Zheng W, et al. Proteomic Analysis Revealed the Potential Role of MAGE-D2 in the Therapeutic Targeting of Triple-Negative Breast Cancer. Mol Cell Proteomics. 2024;23(1):100703.