答疑解惑系列 | IP-MS常见问题（二）

阅读：2310 时间：2023-11-22

问：质谱检测结果可以用来评估IP实验的效果吗？

答：可以。质谱检测结果中诱饵蛋白的信号强度排名可以作为评估IP实验效果的依据。诱饵蛋白排名越高，说明IP亲和富集的效率越好。我们通常以排名前3%作为IP效果较理想的标准，但由于项目不同，抗体效价和IP实验操作的差异，有些IP实验后诱饵蛋白也会排名稍微靠后。

蛋白的信号强度在质谱检测结果中通常以intensity、LFQ intensity或iBAQ等定量数值表示，可以作为蛋白相对定量信息的来源。除此之外，蛋白的肽段数、谱图数的信息也可作为蛋白定量的参考，但准确性不及信号强度。

如果有设置IP空白（阴性）对照组，可根据IP实验组和对照组中诱饵蛋白的定量比值评估IP效果。通常比值越大，表明IP效果越好；若实验组对照组间诱饵蛋白未表现出显著差异，则IP效果不理想。

此外，还可以根据样品中鉴定和定量到的蛋白数目大致评估样品量是否足够。通常在动物细胞/组织中进行IP实验，以beads形式送样进行质谱检测，足量样品可以鉴定到500-3000个蛋白。若蛋白鉴定数目过少，则可能表示实验样品起始量不足，或IP亲和富集实验过程中样品损失过多。

问:IP-MS是基于什么标准筛选互作蛋白的？

答：基于IP-MS质谱数据，可计算IP实验组和对照组中各个蛋白的定量数据，在实验组中定量显著高于对照组的蛋白会被筛选为互作蛋白。本公司默认结果中以差异倍数（Fold change）> 4，T检验P值 <0.05作为互作蛋白的筛选标准。若未设置重复，则无法计算P值，互作蛋白筛选的可信度也会降低。

在同类型发表文献中，互作蛋白的筛选标准中从2倍至10倍都有采用，目前并无公认统一的筛选标准。

在部分样品中未鉴定到、或未采集到定量数据的蛋白，会被填充一个代表质谱检测下限或检测背景信号的随机小值，以参与差异计算。

问：有哪些常用的互作蛋白数据库可以检索已知的互作蛋白？

答：STRING（https://cn.string-db.org/）是目前最大的蛋白互作数据库，收录了来源于12535种不同物种的超过200亿项蛋白互作信息。其数据库自带的互作网络构建和可视化功能也是目前最常用的蛋白互作网络绘制工具。

BioGrid（https://thebiogrid.org/）也是目前常用的一个蛋白互作数据库，目前版本已收录了来源于83418篇发表文献中的超过260万项蛋白或基因互作信息。其中每一项收录的蛋白互作信息均具有文献来源和对应的实验方法信息。

还有一些其他数据库资源，包括：DIP（https://dip.doe-mbi.ucla.eu/）、IntAc（https://www.ebi.ac.uk/intact/home）、 MINT（https://mint.bio.uniroma2.it/）等也是比较权威的蛋白相互作用数据库。

问:为什么有些已知的互作蛋白，通过IP-MS没有鉴定到？

答：一方面，这可能是由于生物系统的差异，导致在IP-MS实验中采用的样品里不存在该类蛋白互作。不同细胞类型、组织类型或物种间，甚至同种细胞不同培养条件下，其蛋白相互作用本身可能存在差异。在之前研究中证实的蛋白相互作用，如果换另一种生物系统并不一定能够仍然存在。

另一方面，在实验采用的生物系统中确实存在的蛋白相互作用，也不一定能保证都可以使用IP-MS鉴定到。受限于技术本身的特点，特定类型的蛋白相互作用，例如核蛋白、膜蛋白或某些互作程度较弱的蛋白相互作用，在IP-MS的实验过程中可能难以分离或保留，因此鉴定到的难度较大。

此外，有些时候也需要衡量和评估该已知相互作用的证据来源和可信度。

问：IP-MS筛选出了很多互作蛋白，选哪一个进行后续研究和验证？

答：选择哪些蛋白进行后续研究和验证，目前并无公认有效和保证可行的方法。可以参考以下思路和原则：