期刊名称：Frontiers in immunology

影响因子：7.3  

期刊分区：JCR 1区/中科院医学2区

发表时间：2023年5月

作者单位：华中科技大学武汉市金银潭医院、华中科技大学同济医学院协和医院

样本类型：小鼠的血清和肺组织

定量方法：DIA+PRM

其他信息：急性呼吸窘迫综合征，生物标志物 

 

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前言

 

今天和大家分享一篇由华中科技大学武汉市金银潭医院张定宇团队和华中科技大学同济医学院附属协和医院尚游团队合作发表的文章，标题为“Integrative proteomic profiling of lung tissues and blood in acute respiratory distress syndrome”，于2023年5月发表在Frontiers in Immunology（IF=7.3）上，我司的周欣工程师是文章的共同作者。

 

 

研究背景

 

急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）占ICU入院人数的10.4%，死亡率达34.9%~46.1%，表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫。ARDS具有各种潜在病理机制，通常由“直接”肺损伤（如肺炎、误吸）或“间接”肺损伤（如败血症、胰腺炎）引起。最近有研究根据氧合指数等临床特征和IL-6、IL-8等炎症生物标志物水平，将ARDS分为“高炎症”和“低炎症”两种亚型。其中高炎症ARDS亚型与预后不良和高死亡率相关。因此迫切需要开发生物标志物作为预测因子，对高炎症亚型ARDS进行及时的诊断和干预。

 

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蛋白质组学检测样本

 

ARDS/ALI小鼠模型构建：30只8~10周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组和实验组，每组15只。实验组气管内注射5 mg/kg内毒素建立ARDS/ALI模型，对照组给予相应体积的PBS。处理24 h后处死小鼠，取血液、支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织标本。

其中用于DIA定量蛋白质组学的样本为小鼠肺组织样本和血清样本，每组各5只。用于PRM靶向蛋白质组学的同样为小鼠肺组织样本和血清样本，每组各3只。

 

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实验设计

 

构建ARDS/ALI小鼠模型，采集小鼠的血清和肺组织进行DIA定量蛋白质组学分析，并分别筛选差异表达蛋白，从中随机挑选差异蛋白进行PRM靶向蛋白质组学验证，并在转录组数据库中验证。此外，作者还将此次蛋白质组学的数据与前期研究中患有新冠并发ARDS的患者的蛋白质组学数据进行联合分析。

图1 实验方案图

研究结果

 

（1）小鼠ARDS模型的建立

通过检测模型小鼠刺激24小时后BALF中的蛋白质浓度、细胞计数以及肺部湿/干比、肺组织HE染色和肺损伤评分，确定ARDS/ALI小鼠模型建立成功。

图2 ARDS/ALI小鼠模型的验证

 

（2）小鼠肺组织蛋白质组学分析

总共筛选到504个差异蛋白，其中376个上调蛋白，178个下调蛋白。之后对差异蛋白进行GO富集、KEGG富集和PPI互作网络分析，找到关键信号通路及相互作用核心子网络。

 

图3 ARDS小鼠肺DEP的识别和生物信息学分析

 

（3）小鼠血清蛋白质组学分析

总共筛选到368个差异蛋白，其中281个上调蛋白，87个下调蛋白。之后对差异蛋白进行GO富集、KEGG富集和PPI互作网络分析，找到关键信号通路及相互作用核心子网络。

 

图4 ARDS小鼠血清DEP的识别和生物信息学分析

 

（4）差异蛋白的PRM验证

将血清蛋白质组学数据与肺组织蛋白质组学数据进行交集分析，找到50个共同的上调蛋白和10个共同的下调蛋白（共60个DEPs）。之后，从这些共同蛋白中随机选择13个蛋白质进行了PRM验证，与蛋白质组分析中表达趋势基本相同，证实了数据的可靠性。

图5 ARDS小鼠血清和肺部的同趋势DEPs的发现和验证

 

（5）随机选择差异蛋白进行外部数据集验证

 

使用GEO数据集（GSE 104214和GSE 2411），对小鼠肺组织的蛋白质组学数据进行转录组学的数据比对。随机验证20个常见的差异蛋白的基因表达水平，发现其中18个差异蛋白的基因在GSE 104214中表现出显著的差异表达，15个基因在GSE 2411中表现出显著的差异表达。

本次发现的60个共同DEPs的小鼠基因，通过MGI数据库映射到了62个人类同源基因（52个上调蛋白和10个下调蛋白）。基于作者先前的新冠肺炎诱导的ARDS患者的肺组织和血浆样本的蛋白质组数据，鉴定到31个在肺组织中显著差异表达的人类同源蛋白和12个在血浆样本中显著差异表达的人类同源蛋白。

随后，作者从a) 来自小鼠的52个上调的共同差异蛋白的同源蛋白质和b) 来自ARDS患者的肺组织和血浆样本的上调蛋白质组结果的交集构建了一个数据集。从这个数据集中，识别了6个在肺组织和血液中有共同上调趋势的目标DEPs。

图6 共同DEPs的外部数据验证

 

 

（6）目标DEPs的临床价值评估

为了进一步评估这六个蛋白的临床价值，基于上述新冠肺炎ARDS患者（包括5名死亡患者、7名重症患者、10名轻度患者和8名健康受试者）的蛋白质组学数据生成了ROC曲线，发现有5个蛋白质的AUC值大于0.8。

此外，还探讨了这些蛋白质在不同临床结局的ARDS患者中的预后价值，发现它们在血浆中的水平随着新冠肺炎病情加重而显著升高，显示出良好的临床预测价值和广阔的应用前景。

 

图7 目标蛋白的临床价值评估

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结论

 

在本研究中，作者首先构建直接肺损伤导致的经典高炎性ARDS小鼠模型，随后对小鼠的血清和肺组织进行DIA定量蛋白质组学检测，并对差异蛋白进行生物信息学分析。之后，随机选择差异蛋白进行PRM靶向蛋白质组学验证和外部转录组学数据集验证。作者还将此次蛋白质组学数据与前期研究中新冠肺炎并发ARDS患者的肺组织和血浆蛋白质组数据进行交集分析，找到6个关键蛋白。通过分析这些蛋白的临床效用，发现它们具有良好的临床诊断和预后价值。

 

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总结

 

首先，本研究中使用的DIA+PRM是现在比较常用的一种蛋白质组学技术组合，先通过DIA筛选关键蛋白，再用PRM验证数据可靠性。相对于经典的WB和ELISA来说，PRM实验结果不受抗体质量的影响，且通量高，同时可检测几十个蛋白。此外，PRM根据特定肽段序列来进行鉴定和定量，定量的准确性和重复性也非常好。

其次，本文采用了“干”“湿”结合的研究思路，通过蛋白质组学获得实验的大量数据，再通过数据库的比对和挖掘对实验数据进一步验证和深入分析，丰富了结果内容。

但本文也有一些局限性，包括样本量比较小，ROC分析没有在独立的验证集中进行等。另外，文中只分析了组织和血液中变化趋势一致的蛋白质，其实变化趋势不同的蛋白质也同样值得关注。

 

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参考文献

 

Gong R, Luo H, Long G, Xu J, Huang C, Zhou X, Shang Y, Zhang D. Integrative proteomic profiling of lung tissues and blood in acute respiratory distress syndrome. Front Immunol. 2023 May 1;14:1158951. doi: 10.3389/fimmu.2023.1158951. PMID: 37197655; PMCID: PMC10184823.

 

本文由谱度众合“生物标志物发现与药物靶点筛选平台”（该平台被认定为“国家生物产业基地公共服务平台”）完成蛋白质组学检测及分析工作。