期刊名称：Phytomedicine                 

发表时间：2022年6月

影响因子：7.9

期刊分区：医学1区

作者单位：北京协和医院                

定量方法：LFQ                 

样本类型：PBMC

其他信息：网络药理学、药物靶点、分子机制研究

前言

今天和大家分享一篇文章，于2022年6月份发表在Phytomedicine （IF=7.9）杂志上，标题为“Combined multi-omics and network pharmacology approach reveals the role of Tripterygium Wilfordii Hook F in treating HIV immunological non-responders.”

研究背景

艾滋病是由HIV引起的一种致命性传染病，主要病理特征为长期免疫激活导致的CD4+T淋巴细胞数量显著降低，在经联合抗逆转录病毒治疗（cART）后，仍有10–40%感染者无法实现良好的免疫重建，这部分患者被称为HIV感染的无免疫应答者（INRs)，其各种相关并发症和死亡率的风险明显增加。持续的系统性慢性免疫激活被认为是免疫重建失败（INRs）的主要病理机制，且有研究表明干扰素（IFN）反应途径的增强激活是INRs免疫激活的重要特征。雷公藤（TwHF）作为传统中药材，一直被用于治疗自身免疫疾病和炎症性疾病。作者团队在过往的研究中发现雷公藤能够调节INRs患者的T细胞激活，另外还有两个团队报道了TwHF 在HIV长期感染者（PLWH）中的临床疗效。本文通过收集感染HIV的无免疫应答者的外周血单核细胞，通过多组学分析和网络药理学分析相结合的方法，预测并初步验证了雷公藤治疗感染HIV的无免疫应答者的效应靶点和分子机制。

 

蛋白质组学研究样本

 

感染HIV的无免疫应答者（INRs）的外周血单核细胞（PBMC）。

 

实验设计

采集治疗前后患者的外周血单核细胞，结合转录组学和蛋白质组学以及网络药理学预测雷公藤的活性化合物以及反应途径、作用靶点，最后通过细胞实验进行验证。

研究的患者于2011年1月1日至2021年2月28日期间在北京协和医院(PUMCH)感染性疾病科HIV/AIDS门诊招募。

入选标准为：

（1）年龄≥18岁。

（2）确诊为慢性艾滋病感染者。

（3）接受常规cART治疗，病毒得到控制(病毒载量< 20拷贝/ml)。

（4）接受TwHF治疗3个月以上。

图1 中药网络药理学研究思路

 

表1 患者的主要临床特征

研究结果

 

1、TwHF治疗期间PLWH临床CD4恢复情况

纳入了来自PUMCH HIV/AIDS中心的33名慢性感染的PLWH。尽管接受cART治疗的平均时间为3.3年，但他们的CD4+ T细胞计数仍低至176 (IQR, 133-240)个细胞/ul。这些患者口服TwHF丸的中位持续时间17 (IQR, 12-26)个月后，CD4+ T细胞计数快速增长（主要是记忆T细胞，而不是naïve T细胞）。在TwHF治疗期间，CD4/CD8比值逐渐升高，治疗后T细胞活化谱降低，特别是HLA-DR+CD38+在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上共表达。表明雷公藤（TwHF）具有改善CD4+ T细胞、抑制免疫激活的临床疗效。

图2 TwHF治疗期间PLWH临床CD4恢复情况

 

2、结合转录组学和蛋白质组学分析的重叠结果确定了IFN的反应途径

收集TwHF治疗后CD4恢复最佳(6个月内CD4恢复超过100/μl)的INR患者PBMC样本的不同时间点(3个时间点:基线、V1—治疗后随访3个月、V2—治疗后随访6个月)。与基线水平相比，V1中鉴定出601个DEPs(421个上调，180个下调)和803个DEPs(382个上调，421个下调)，V2中鉴定出158个DEGs(28个上调，130个下调)和791个DEPs(373个上调，418个下调)。DEPs和DEGs的重叠度低至1.8%、2.0%、1.5%和0.5%，表明在TwHF处理下可能存在广泛的转录后调控。

 

 

图3 TwHF治疗前后DEPs和DEGs

IFI27、MX2、DTX3L、HSPA1A四个基因的转录和翻译在不同时间点被TwHF持续下调。IFI27和MX2都是IFN刺激基因(ISGs)，已有研究报道IFI27水平与CD4+ T细胞计数呈负相关(Fernandez等，2011;Liu et al, 2022)。IPA富集结果显示，TwHF的应用显著抑制了几种炎症反应通路，尤其是IFN信号通路。

 

图4 IPA富集分析结果

课题组还测量了接受TwHF治疗的INR患者血浆样本的细胞因子水平。经TwHF治疗后，IP-10和CRP水平明显降低，而IFN-α2、IFN-γ等细胞因子保持稳定。这些结果表明TwHF对IFN信号和下游细胞因子表达的显著抑制作用。

图5 TwHF治疗前后细胞因子水平变化

 

3、网络药理学方法预测了STAT1的核心作用

 

网络药理学方法的工作流程包括生物活性化合物的整合、靶点和相互作用预测、网络构建和分析。作者检索了TCMID、TCMSP、TCMIP和TCM@TW数据库，剔除重复以及经过药物相似度（DL）和口服生物利用度（OB）评估后共收集了75个TwHF化合物，再通过检索和预测，共获得了499个与活性化合物相关的靶点。同时，基于多组学分析筛选得到了720个差异基因/蛋白，作为INR相关靶点。通过STRING 数据库进行蛋白互作分析（PPI），在这499个TwHF靶点中，26个基因是INRs的共同靶点(第1靶点)，212个基因是相互作用的靶点(第2靶点)，138个基因是间接作用的靶点(第3靶点)，123个基因预计与INR靶点不相互作用(第4靶点)。

图6 蛋白互作网络

 

结合多组学的结果，在第1靶点中有四个基因在INR患者中上调，而在TwHF治疗后下调，分别是STAT1、EIF2AK2、EPHB2、ETFB。其中STAT1、EIF2AK2和 IFN反应途径密切相关，同时转录组学结果表明有58.8%的DEGs与STAT1有相互作用。因此网络药理学预测STAT1在“疾病-靶点-药物” 网络中起核心作用。

图7 TwHF治疗后表达下调的基因

 

4、验证雷公藤甲素（TPL）对IFN反应和STAT1的影响

 

在75种具有生物活性的TwHF化合物中，TPL有文献记载与STAT1相互作用。研究比较了TPL与TwHF丸提取物和其他TwHF化合物（包括雷公藤红素、雷公藤内酯等）的体外活性，结果显示TwHF丸提取物、TPL、雷公藤红素、雷公藤内酯对CD4+ T细胞和CD8+ T细胞上HLA-DR、CD38、Ki-67、PD-1的表达均有不同程度的抑制作用。而只有TPL和高剂量TPL治疗显著抑制CD4+T细胞和CD8+ T细胞中IFN-γ的产生。此外，TPL和TwHF丸提取物可抑制PLWHsPBMC中ISGs(即IFI27、ISG15、Mx1和Mx2)的表达。

 

 

 

图8  TwHF化合物治疗后CD4+ T细胞活化标志物表达的变化和PBMC上ISGs的相对表达

 

Western blot分析显示，TPL和TwHF丸提取物能促进pSTAT1的降解且呈剂量依赖性，而其他化合物对其无显著影响。

图9 pSTAT1和STAT1在TwHF化合物作用下的western blot分析

结论

 

本研究结合转录组学、蛋白质组学、网络药理学预测并发现TwHF治疗的主要作用靶点及主要作用途径为STAT1/pSTAT1和IFN信号通路。而TPL为TwHF的主要生物活性化合物，可抑制IFN反应的激活以及STAT1的磷酸化。并通过进一步的分子实验进行了验证。

 

总结

 

本研究先结合了多组学和网络药理学的方法，通过干-湿数据的比较和相互作用网络分析，对中药的作用靶点进行了预测，再通过分子实验进行验证。这种方法非常适合中药靶点研究，一定程度上克服了其多靶点、多通路、多活性化合物的难点，值得借鉴。本研究的不足之处在于，可能是考虑到伦理问题，实验设计并非以不给药组为对照，而是将患者自身治疗前后的样本进行比较。另外，对于雷公藤治疗INRs的临床效果，还需在更大的多中心临床队列中验证。

 

参考文献

 

Liu X, Lin L, Lv T,Lu L, Li X, Han Y, Qiu Z, Li X, Li Y, Song X, Cao W, Li T. Combined multi-omicsand network pharmacology approach reveals the role of Tripterygium WilfordiiHook F in treating HIV immunological non-responders. Phytomedicine. 2022Jul;101:154103. doi: 10.1016/j.phymed.2022.154103. Epub 2022 Apr 17. PMID:35468451.