发掘FFPE样品潜力 | 解读《蛋白质组学预测早期结直肠癌淋巴结转移》

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文献解读

阅读：981 时间：2023-09-04

期刊名称：eLife

发表时间：2023年5月

影响因子：7.7

期刊分区：JCR 1区/中科院生物学1区Top

作者单位：复旦大学中山医院癌症中心

定量方法：Label-free

样本类型：FFPE

其他信息：结直肠癌，生物标志物，221例

01 前言：

今天和大家分享一篇应用蛋白质组学技术分析福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本来预测早期侵袭性结直肠癌（T1 CRC）淋巴结转移（LNM）的文章，于今年5月发表在双一区Top杂志eLife（IF=7.7）上，标题为“Proteomic characteristics reveal the signatures and the risks of T1 colorectal cancer metastasis to lymph nodes”。

该文章建立了蛋白模型预测 T1 CRC患者是否发生LNM，且该模型在验证队列中的表现良好；还探索了T1 CRC的转移机制，可用于T1 CRC患者LNM的个体化预测，从而为T1 CRC的临床实践提供指导建议。

02 研究背景：

CRC作为全球第三大常见癌症，其相关死亡在全球范围内排名第二。研究显示，对于LNM发生风险较低的T1 CRC患者，内窥镜黏膜下剥离（ESD）是有效的治疗手段，只有高危患者需要再次手术。然而现有的风险分层工具将70%–80%的患者归为高危患者，大量非LNM患者进行不必要的二次手术，增加了死亡风险。因此，迫切需要新的方法预测T1 CRC患者的LNM情况。

本研究通过比较LNM阴性和LNM阳性T1 CRC患者的FFPE样本的蛋白质组学差异，构建蛋白模型预测T1 CRC患者是否存在LNM，有助于提供更加精准的医疗决策。

03 研究样本：

143名LNM阴性和78名LNM阳性T1 CRC患者FFPE肿瘤切片。

04 实验设计：

该研究为巢式病例对照设计，作者收集了在复旦大学中山医院被确诊为T1 CRC的患者，分成一个训练队列（N=132）和两个独立的验证队列（N=42；N=47）。其中训练队列和验证队列1为回顾性队列，验证队列2为前瞻性队列。

所有队列的纳排标准相同，纳入研究的患者年龄均为18-80岁、接受根治性手术切除，且根据TNM分期系统及病理检查被诊断为CRC、粘液腺癌或印戒细胞癌合并PT1病。排除标准包括仅接受ESD治疗、有家族肠病史、并发浸润性癌症、接受术前放疗或化疗以及数据缺失的患者。

收集这些患者肿瘤组织的FFPE切片，使用Label-free定量蛋白质组学技术进行检测，比较LNM阴性和LNM阳性T1 CRC患者的蛋白质组学差异。

图1 样本选择

05 研究结果：

（1）差异蛋白分析

将文献中已报道的44种CRC LNM蛋白标志物与本研究测得的蛋白质表达相对照，发现报道的标志物中只有CTSD、GSTM3和MX1在本研究的LNM阴性和LNM阳性患者之间存在差异表达，提示过去的研究或许未能反映T1 CRC的淋巴结转移状态。

比较LNM阴性和阳性患者的蛋白质组学差异，发现166种显著差异表达的蛋白质（在30%的样本中发现、差异倍数>2且P<0.05）。有84种蛋白质在LNM阳性患者中上调，其中19种是FDA批准的药物靶点，34种是潜在的药物靶点。

图2 差异蛋白分析结果

（2）基因集富集分析（GSEA）

进一步使用GSEA富集分析探索T1 CRC中与LNM相关的通路。LNM阳性组在上皮细胞-间充质转化（EMT）通路显著富集，LNM阴性组没有显著富集的通路。进一步探究EMT通路相关蛋白的表达发现，LNM阳性组中6种蛋白的表达显著上调。为了验证这些EMT相关蛋白是否为T1 CRC独有，研究使用了两个已发表且包含T1-T4所有阶段CRC患者的数据集（CAPTAC、mCRC），比较它们LNM阳性组和LNM阴性组中这6种蛋白的表达。结果显示，这些蛋白在CPTAC或mCRC队列中的表达并无统计学差异。仅纳入早期（T1/T2）CRC患者时，部分蛋白的表达（SERPINE2和LRP1）才显示出显著的组间差异，提示EMT可能在早期CRC的LNM过程中发挥重要作用。

图3 基因集富集分析结果

（3）单样本基因集富集分析（ssGSEA）

不同于以组别为单位的GSEA分析，ssGSEA可为每个样本提供相应基因集的评分。通过这种方式，ssGSEA将单个样本的基因表达谱转换为基因集富集谱，从而使研究人员能够根据生物过程和途径的活性水平而不是通过单个基因的表达水平来描述细胞状态。

采用ssGSEA对166个显著差异表达的蛋白质进行分析结果显示，LNM阴性组在氨基酸代谢途径中显著富集，而LNM阳性组主要表达脂质代谢途径，表明不同的代谢途径和信号通路可能参与了T1 CRC LNM的发生。

图4 单样本基因集富集分析结果

（4）预测蛋白模型

在训练队列中筛选407种候选蛋白（在30%的样本中发现且P <0.1），利用LASSO-logistic回归构建包含55种蛋白的分类器。与NCCN临床指南相比，该分类器可以更准确地区分LNM阴性和LNM阳性的T1 CRC患者。将更多无转移的患者归为低风险组，减少了过度治疗的发生，这将为T1 CRC患者治疗的临床决策提供有价值的见解。

进一步从55种蛋白中选择至少2倍差异表达的19种蛋白进行多元Logistic回归，得到包含9种蛋白（ATAD2, CEACAM6, COMMD10, FARS2, ITPR2, RHOT2, SERPINB5, SWAP70, VRK2）的简化分类器。在CAPTAC、mCRC队列中验证发现该分类器不会遗漏任何已发生LNM的患者。

图5 预测蛋白分类器的开发与验证

（5）免疫组化（IHC）验证蛋白模型

使用IHC对19种差异表达蛋白中的13种在LNM阴性和LNM阳性的FFPE标本中进行了染色，生成染色量表。与蛋白质组学数据一致，ABI1、ITPR2和RHOT2在LNM阴性患者中有所增加；而ATAD2、ISLR在LNM阳性患者中有所增加，其余蛋白在两组间没有显著差异。

为了验证IHC结果，额外收集了47名T1 CRC患者的FFPE样本检测ABI1、ITPR2、RHOT2、ATAD2和ISLR的表达情况。通过AUC评估单个蛋白质对区分有无LNM患者的预测能力，5个差异表达蛋白均显示出良好的区分性。

进一步利用二元logistic回归建立包含这5种蛋白的简化分类器，该分类器仍有较好的区分性。生存曲线显示，与RHOT2低表达患者相比，高表达患者预后更好。提示RHOT2在T1 CRC患者LNM中可能起重要作用。

图6 免疫组化结果

（6）RHOT2作用机制

对RHOT2相关蛋白进行单基因GSEA分析，结果显示，与RHOT2正相关的蛋白仅在线粒体通路显著富集；而与RHOT2负相关的蛋白在EMT、扩张性心肌病、补体和凝血级联、局灶粘连、细胞外基质与受体的相互作用通路显著富集。

通过Western blot实验，研究检测了人CRC细胞（SW480、HT29、HCT-116、RKO、DLD1和LoVo）中RHOT2的表达情况。结果显示，RHOT2在所有CRC细胞系中均有表达。利用RHOT2干扰片段使细胞中RHOT2低表达，CRC细胞的迁移能力显著提高。

图7 RHOT2细胞验证结果

06 结论：

这项研究采用非标记定量蛋白质组学方法，对221名T1 CRC患者的FFPE样本进行了分析，揭示LNM+/-患者之间不同的蛋白质组特征。并在训练队列中构建高效蛋白模型预测患者LNM状态，该模型在验证队列、外部队列中均表现良好，可为医生提供已经过手术的T1 CRC患者是否需要进一步根治性手术的决策支持。研究还通过细胞实验，验证RHOT2低表达显著增加CRC细胞的迁移，可能与LNM的发生和预后不良有关。这些发现为深入理解T1 CRC的病理机制提供了宝贵的线索，并为临床实践中的决策制定提供了新的视角。