前言

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs) 是指在翻译后的蛋白质氨基酸侧链及其C/N末端引入新的基团(如磷酸基、乙酰基等)。PTM在细胞分化、蛋白质降解、信号传导和调节、基因表达调节以及蛋白质互作过程中起着关键作用。

液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术是进行蛋白质修饰鉴定的首选技术，可以同时实现修饰类型、修饰位点的鉴定以及修饰的相对定量。本文主要介绍基于质谱的蛋白质翻译后修饰鉴定原理，并分析修饰鉴定和修饰组学产品的区别以及相关的技术难点。

修饰鉴定原理

蛋白质的不同氨基酸位点可以在相关酶的作用下共价结合不同的官能基团以实现多种类型的翻译后修饰，常见的包括磷酸化(Phosphorylation)、乙酰化 (Acetylation)、泛素化(Ubiquitination)、甲基化(Acetylation)等，因此修饰鉴定既需要确认修饰的位点，又需要鉴别修饰基团的种类。发生翻译后修饰的蛋白质在分子质量上会发生相应的增加，而每种官能基团的分子质量是已知的，通过检测具体增加的分子质量，就可以确定修饰的类型。质谱技术能够检测到这种分子质量的变化从而定性地鉴定修饰类型，还可以结合一级/二级质谱数据和相关理论数据库以及生物信息学分析方法，确定修饰发生的氨基酸位点并进行相对定量。                                                

修饰鉴定的技术难点

难点一：非常见修饰的富集方法不成熟

在大部分生物系统中，蛋白质发生翻译后修饰的比例都较低。以最常见的磷酸化修饰为例，虽然在人体表达的20000多种蛋白质中，大部分都可能发生磷酸化修饰，但磷酸化修饰的比例往往不足1%。举个例子，如果细胞中存在10000个A蛋白分子，其中可能只有100个甚至更少的蛋白分子A在特定位点发生了磷酸化修饰。

受限于目前检测仪器的分辨率和灵敏度，为了降低无修饰蛋白和其他蛋白的干扰，充分检测生物系统中的PTM，往往需要针对待检测修饰类型的蛋白进行富集和纯化。目前研究较多的修饰类型，如磷酸化、乙酰化、泛素化等，已经有较为成熟的修饰富集方法。但一些研究较少或者本身在生物系统中较罕见、比例较低的PTM，其富集方法可能不太完善，富集效率也难以保证。

难点二：修饰分子量偏差不确定或过大

如前文所说，基于质谱的翻译后修饰鉴定原理是识别修饰导致的分子量偏差，因此更适合于检测分子量偏差固定且在质谱常规检测范围内的翻译后修饰。如果某种翻译后修饰造成的分子量偏差种类太多，或偏差过大超出质谱检测的分子量范围，则往往需要结合其他方法进行处理，通常是采用酶解或置换反应，将原本难以检测的修饰基团转换为更易于检测的基团。

例如糖基化修饰，根据糖链的结合方式和位置可分为N糖基化和O糖基化，并且不同的糖链糖型具有不同的分子量，因此难以直接鉴定；目前只有针对N糖基化的质谱鉴定方法较为成熟，可以通过去糖基化酶处理切除糖链，识别糖链切除后的残基带来的分子量偏差来鉴定蛋白质的糖基化修饰。又比如泛素化修饰和聚泛素化修饰，有多种泛素链结合方式、且修饰基团分子量普遍偏大，通常是通过胰酶酶解，将泛素链切除，仅识别残留的双重甘氨酸残基。因此，此类修饰通常仅能鉴定修饰所在的位置，而无法鉴定和区分修饰的具体糖链或聚泛素链类型。

修饰鉴定和修饰组学产品比较

目前本公司可以提供两类翻译后修饰相关的检测分析服务。一类是目的蛋白的修饰鉴定，主要针对纯化富集的特定蛋白进行检测分析，以鉴定修饰类型和修饰位点。另一类是定量修饰组学，主要针对特定的修饰类型进行富集、检测和分析，从而比较不同样品中各个修饰位点的定量差异。

目的蛋白修饰鉴定的检测样本通常是分离纯化后的蛋白胶条、beads或体外反应溶液，要求样品中蛋白组成较简单、且待测靶标蛋白含量较高。理论上在一次检测中可分析所有可能的翻译后修饰类型，但实际应用中受限于分析算法和计算机的性能，建议单次分析中重点关注的修饰类型不超过3种。

定量修饰组学通常以组织或细胞为待测样品，需要根据待分析的修饰类型选择不同的修饰富集方法，因此对样品的起始蛋白含量要求较高，并且每次检测只能够分析选定的一种修饰类型。需要注意的是，由于定量修饰组学是对富集之后的肽段进行修饰位点的相对定量，并不能确定修饰水平的变化是来源于修饰比例的变化还是蛋白整体水平的变化。因此在研究中，通常会结合常规的定量蛋白质组学，根据蛋白本身的表达水平进行修饰定量的校正。

总结

基于质谱的蛋白质翻译后修饰鉴定和定量分析是目前研究PTM的最重要的方法之一，质谱检测的二级谱图可作为修饰位点鉴定的最直接和最有力的证据。受限于修饰发生比例和目前检测仪器的性能，为了提高修饰鉴定和定量的效果，在分析前需要进行纯化富集。针对目标蛋白进行纯化富集之后的目的蛋白修饰鉴定，适用于对目标蛋白的修饰类型和位置进行检测分析；而定量修饰组学则更适用于对不同样品中的特定修饰进行相对定量比较，进而找到修饰发生变化的靶标蛋白、位点或信号通路。