文章特点

01 采用回顾性研究设计；

02 蛋白质组学检测样本量较少，检测成本较低；

03 采用血浆样本，微创，易获取；

04 蛋白标志物与临床指征联合建模，用于疾病预后情况预测。

前言

今天和大家分享一篇2023年1月份发表在 Molecular & Cellular Proteomics（IF=7.38）杂志上的文章，标题为“高级别浆液性卵巢癌血浆蛋白标志物的蛋白质组学发现以及预后模型的建立”。 

研究背景

卵巢癌是女性最致命的癌症之一，具有很高的复发率和死亡率。在卵巢癌的亚型中，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）最为常见，占所有卵巢癌的70%。

本文作者在之前的研究中已经通过HGSOC组织样本的蛋白质组学分析确定了六种与无进展生存期（PFS）相关的蛋白标志物。鉴于液体活检具有更多优点，例如无创，快速，实时监测以及提前鉴别肿瘤异质性的可能性，因此本研究旨在通过质谱技术从血浆样本中鉴定出新的HGSOC预后蛋白标志物。

实验设计：回顾性研究

这项研究包括三个阶段：（1）通过蛋白质组学和生物信息学发现蛋白标志物；（2）使用ELISA对候选蛋白标志物进行预后验证；（3）构建模型用于预测HGSOC患者18个月PFS率（如图1所示）。

第一阶段收集了2012年6月至2016年12月期间新诊断为HGSOC患者的血浆样本（n = 20）；根据PFS情况， 将样本分为两组：预后良好组（PFS≥18个月）和预后不良组（PFS<18个月），并对两组患者样本进行蛋白质组学分析，发现了96个差异蛋白，进一步结合数据库分析，从中筛选到了6个候选的蛋白标志物。第二阶段收集了2012年6月至2019年12月期间的HGSOC患者的血浆样本（n=202）；并对这6个候选蛋白标志物进行进一步ELISA验证。最后作者结合蛋白标志物和重要的临床指标构建了预测18个月PFS率的模型。

表1：基线资料，发现阶段20例进行蛋白质组学分析的HGSOC患者的临床病理特征（左），验证阶段202例HGSOC患者的临床病理特征（右）。

结果一：HGSOC患者血浆蛋白质组学分析

从收集的20例血浆样品中，通过非标记定量的蛋白质组学方法，共鉴定1912种蛋白质；每个样品平均定量1082个蛋白质（图2A）。接着，对1082个蛋白进行主成分分析来比较预后良好组和预后不良组样本之间的定量差异。结果显示两组样本在PCA图中可以从空间上区分开来（图2B），说明组内样本的重复性和组间样本的区分度都比较好。

（图2）

随后，以 |FC|>1.5，P<0.05为标准，在预后良好组和预后不良组间筛选出96个表达量显著差异的蛋白（图3A）。通过对这些差异蛋白进行基于生物过程的GO富集分析，预后良好组上调的蛋白质在“肌动蛋白丝组织”、“脂肪酶活性调节”、“细胞对化学应激的反应”、“葡萄糖6-磷酸代谢过程”和“细胞死亡调节”等方面显著富集（图3B）。相反，预后不良组上调的蛋白质在“中性粒细胞脱颗粒”、“中性粒介导免疫”、“天冬氨酸代谢过程”和“脂蛋白颗粒清除负调节”中显著富集（图3C）。

（图3）

结果二：预后蛋白标志物的选择及验证

作者结合先前关于肿瘤组织样本的研究数据，综合考虑以下几个因素选择蛋白进行验证：（1）蛋白在组织和血浆样本中表达模式一致，（2）以预后不良的患者样本中上调的蛋白优先（更适合作为蛋白标志物）;（3）蛋白有成熟的商业ELISA试剂盒，（4）ELISA试剂盒在本研究实际测试中的可用性。最后，选择GSN、VCAN、SND1、SIGLEC14、CD163和PRMT1作为验证阶段的候选蛋白标志物（图4）。

（图4）

随后，作者在验证队列中（n=202）中对这六种蛋白质标志物进行验证（表2），发现血浆中高水平的GSN与短PFS的预后结局相关，而VCAN，SND1，SIGLEC14，CD163和PRMT1不影响HGSOC患者的生存结局（图5）。血浆GSN被确定为HGSOC中PFS的不良预后蛋白标志物。

表2：ELISA 结果与患者临床病理特征的比较

（图5）

接下来，作者结合临床变量和HGSOC患者（n=202）中五种血浆蛋白标志物的血浆水平预测18个月的PFS率（SND1被排除在外，因为在验证阶段，高SND1组的PFS优于低SND1组，这与发现阶段的结果相反），构建了基于回归的模型。通过逐步选择方法，选择4个预测因子：FIGO分期、术后残留肿瘤、GSN和VCAN，使用这些预测因子开发了各种模型，每个预测模型都经过五重交叉验证以计算 AUC。其中，使用GSN（24.350 ng/mL）和VCAN（5.832 ng/mL）血浆水平cut-off值的模型显示出最佳的预测性能，AUC为0.779（图6A、6C）；比使用血浆GSN和VCAN水平的连续值模型更好（图6B、6D）。

（图6）

结论

本文作者利用蛋白质组学技术，确定了与HGSOC疾病预后相关的六种蛋白标志物，并通过ELISA验证评估了六种蛋白标志物的预后价值；确定血浆GSN为预后蛋白标志物。最后，结合重要临床指标(如：FIGO等)，构建了疾病预后模型来预测18个月PFS率，从而实现对患者未来疾病进展情况的预测。

总结

本文旨在寻找血浆中的蛋白标志物，相对于组织样本来说具有创伤更小，可实时检测的优势。在统计方法上使用了五折交叉验证，可以有效的防止模型的过拟合，提高模型的鲁棒性和准确性。

本研究中建立了HGSOC疾病预后模型，但并未进行更深入的疾病机理探索和讨论。如果对其结果进行更深入的生物信息学分析和蛋白功能或机理方面的探索验证，可能会对HGSOC的预后分子机制有更详细的阐释。

在实验设计上，该研究使用了回顾性研究设计，可能会存在选择偏倚；并且在发现阶段的样本量较少，可能不足以发现和验证血浆蛋白标志物；而在验证阶段，作者未对预后模型进行外部队列的验证，无法得知模型使用的外延性。

另外，从蛋白质组学检测方法上，本文使用的是非标记定量技术，此技术在血液样本的检测中重复性和检测深度不太理想。我们更推荐使用DIA技术，更适合血液样本的蛋白质组学分析，且重复性更好，极大地提高了定量分析的可信度，有利于更多蛋白标志物的发现。